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雙抗體夾心法測(cè)抗原
更新時(shí)間:2012-02-15   點(diǎn)擊次數(shù):1269次

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2) 加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3) 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4) 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗(yàn)中,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測(cè)。

在一步法測(cè)定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2,圖1-4),如按常法測(cè)讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時(shí),應(yīng)注意可測(cè)范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。

假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。

雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)

雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

2. 雙抗原夾心法測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。


 

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