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ELISA試劑盒雙抗夾心法/一步法檢測(cè)步驟心得
更新時(shí)間:2017-07-05   點(diǎn)擊次數(shù):5103次

ELISA試劑盒雙抗夾心法試劑盒測(cè)抗原的注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作ELISA雙抗夾心法試劑盒檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而可消除RF的干擾。ELISA雙抗夾心法試劑盒ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)。
ELISA試劑盒抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1、將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2、加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。
3、洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
4、加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

5、此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
6、加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。

7、根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
ELISA試劑盒雙抗夾心法試劑盒一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),作一步法檢測(cè)。如按常法測(cè)讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng),因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)時(shí),應(yīng)注意可測(cè)范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
ELISA試劑盒在一步法測(cè)定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過(guò)剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過(guò)剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同。

 

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